Characterization of clusters of CD8+ T lymphocytes, FoxP3+ regulatory T lymphocytes and CD66b+ neutrophils in lung cancer and their impact on immunotherapy
Caractérisation des clusters de lymphocytes T CD8+, T régulateurs FoxP3+ et des neutrophiles CD66b+ dans le cancer broncho-pulmonaire et son impact dans l'immunothérapie
Résumé
Lung cancer is the leading cause of cancer death. Although having benefited from numerous medical advances in the prevention, diagnosis and treatment of cancers, survival of patients suffering from lung cancer remains poor with a 5-year survival of approximately 20%, all stages combined. Nowadays, the immune system influence on tumor control and progression is clearly established. Numerous studies have shown that the immune cell composition of the tumor microenvironment has a strong prognostic and predictive impact on the anti-tumor treatment response. In this context, immunotherapy targeting the PD1/PD-L1 and CTLA4 axis has experienced rapid growth, but only 20% of patients will benefit from this treatment in lung cancer. Beyond the density of immune cells, the mutual influence of immune cells probably affects their anti-tumor functions, thus this factor must be taken into account in the analysis of tumors. This would explain the discrepancies observed between the density of a cell subtype, the expected survival and the observed survival. The team's work has shown the presence of cellular proximities between different immune cells in the tumor stroma. In this work, we determined the impact of these contacts and the cellular mechanisms involved. We quantified, by multiplex immunohistochemistry, the spatial interactions between CD8+ T lymphocytes, FoxP3+ T lymphocytes and CD66b+ neutrophils in the tumor microenvironment of 3 cohorts of patients suffering from non-small cell lung cancer (NSCLC ), treated or not by immunotherapy, radiotherapy and their prognostic and predictive impacts of response to treatment. We completed our study using flow cytometry, gene expression and spatial proteomic and transcriptomic. A Normalized Interaction Index (IND) was calculated to normalize the density of interactions between 2 cell types according to their respective densities. We have shown the prognostic impact of IND, particularly IND CD66b-FoxP3, on overall survival. By flow cytometry, we observed a decrease in the expression of immune checkpoints CTLA-4, TIM-3 and LAG-3 and an increase in the expression of PD-1 on CD8+ T lymphocytes, but not on CD4+ T lymphocytes when IND is high. An analysis of gene expression in the tumor microenvironment showed that IND was related to an immunosuppressive tumor environment, with decreased expression of genes involved in immune cell activation and differentiation, and overexpression of genes from the epithelial side of the epithelial-mesenchymal transition. We confirmed these results by Digital Spatial Profiling by analyzing the expression of immunity proteins at the paucicellular level. We observed an increase in the expression of co-stimulatory and activation proteins on CD8+ T cells in interaction regions, compared to the “free” CD8-enriched regions. The use of an online database of spatial transcriptomic at cellular scale (CosMx) made it possible to confirm the regulation of immune functions in cellular interactions compared to cells “free” of interaction. These cellular interactions influence the response to conventional therapies, notably IND CD66b-FoxP3, but do not seem to modify the efficacy of immunotherapy. Taken together, these results suggest that interactions between neutrophils and FoxP3+ T cells promote CD8+ T cell activation and an effective anti-tumor response, highlighting the complexity of anti-tumor immunity, its organization and the presence of cellular interactions.
Le cancer du poumon est la première cause de mortalité par cancer. Bien qu’ayant bénéficié des nombreuses avancées médicales dans la prévention, le diagnostic et le traitement des cancers, la survie des patients souffrants de cancer du poumon reste médiocre avec une survie à 5 ans d’environ 20%, tous stades confondus. L’influence du système immunitaire sur le contrôle et la progression tumorale est maintenant clairement établie. De nombreuses études ont démontré que la composition en cellules immunitaire du microenvironnement tumoral a un fort impact pronostique et prédictif de la réponse aux traitements. Dans ce contexte, l’immunothérapie ciblant notamment l’axe PD1/PD-L1 et CTLA4 a connu une croissance rapide, mais seulement 20% de patients vont bénéficier de ce traitement dans le cancer pulmonaire. Au delà de la densité des cellules immunitaires, l’influence mutuelle des cellules immunitaires impacte probablement leurs fonctions anti-tumorales et cet élément doit être pris en compte dans l’analyse des tumeurs. Ceci expliquerait les discordances observées entre la densité d’un sous-type cellulaire, la survie attendue et la survie réelle. Les travaux de l’équipe ont montré la présence de proximités cellulaires entre différentes cellules immunitaires du stroma tumoral. Dans ce travail, nous avons déterminé l’impact de ces contacts et les mécanismes cellulaires impliqués. Nous avons quantifié, par une approche d’immunohistochimie multiplexe, les interactions spatiales entre les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T FoxP3+ et les neutrophiles CD66b+ dans le microenvironnement tumoral de 3 cohortes de patients souffrant de cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules (CBNPC), traités ou non par immunothérapie, radiothérapie et leurs impacts pronostiques et prédictifs de la réponse aux traitements. Nous avons complété notre étude par des analyses en cytométrie de flux, d’expression de gènes et de protéomique et transcriptomique spatiale. Un Index d’interaction normalisé (IND) a été calculé pour normaliser la densité des interactions entre 2 types cellulaires par rapport à leurs densités respectives. Nous avons montré l’impact pronostique de l’IND, en particulier l’IND CD66b-FoxP3, sur la survie globale. Par cytométrie en flux nous avons observé une diminution de l’expression des checkpoints immunitaires CTLA-4, TIM-3 et LAG-3 et une augmentation de l’expression de PD-1 sur les lymphocytes T CD8+, mais pas sur les lymphocytes T CD4+ lorsque l’IND est élevé. Une analyse d’expression de gènes dans le microenvironnement tumoral a montré que l’IND était lié à un environnement tumoral immunosuppresseur, avec une diminution de l’expression des gènes impliqués dans l’activation et la différenciation des cellules immunitaires, et une surexpression de gènes du versant épithélial de la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons confirmé ces résultats par Digital Spatial Profiling en analysant l’expression de protéines de l’immunité à l’échelle paucicellulaire. Nous avons observé une augmentation de l’expression des protéines de co-stimulation et d’activation sur les lymphocytes T CD8+ dans les régions d’interaction, comparé aux régions de CD8 « libres ». L’utilisation d’une base de données en ligne de transcriptomique spatiale à l’échelle cellulaire (CosMx) a permis de confirmer la régulation des fonctions immunitaires dans les interactions cellulaires comparé aux cellules « libres » d’interaction. Ces interactions cellulaires influencent la réponse aux thérapies conventionnelles, notamment l’IND CD66b-FoxP3, mais ne parait pas modifier l’efficacité des immunothérapies. L’ensemble de ces résultats suggère que les interactions entre les neutrophiles et les lymphocytes T FoxP3+ favorisent l’activation des lymphocytes T CD8+ et une réponse anti-tumorale efficace, soulignant la complexité de l’immunité anti-tumorale, dont son organisation et les interactions cellulaires présents.
Origine : Version validée par le jury (STAR)